1 TRANSFECCIONES II Biología Molecular 2009 Viernes 22 mayo

2 Interacción de proteínas: Doble híbrido en células de levaduras

3 pAD

4 pBD

5 Plásmidos reporteros

6 Interacción de proteínas: Doble híbrido en células de mamífero

7 pBIND

8 pACT

9 pG5/luc

10 Ejemplo de resultados

11 Enriquecimiento de transfectantesCell sorting Cotransfectando con vectores de expresión para GFP o proteínas de membrana que sean reconocidas por Ac-fluorescentes

12 Transfección estable Por integración Por recombinación homólogaComo episoma Requiere de un marcador de selección en el vector Util para estudios que impliquen inducción de la expresión

13

14 Marcadores de selección eucariontesAgent Action Marker Gene Blasticidin S Inhiben síntesis BlasticidinS deaminase Hygromycin B proteica Gen hyg o hph Puromycin G Neomycin phosphotransferase Zeocina Intercalante del DNA gen Sh ble, se une MTX Inhibits DNA syn Dihydrofolate reductase

15 Marcadores de selecciónG418 (Geneticina) Bloquea la traducción La resistencia es la neomicina fosfotransferasa ( Neor ) Para células de mamífero, plantas y levaduras Zeocina - Antibiótico de la familia bleomicina - Cliva el DNA - El producto del gen ble se une e impide el pegado al DNA. -de amplio espectro (mamíferos, levaduras y bacterias)

16 Sistema reprimible por tetraciclina

17 Sistema inducible por tetraciclina

18 Vector de expresión del regulador

19 Vector de expresión del regulador

20 Vector de clonado del gen de interés

21 Vector de expresión para dos genes regulados por tet

22 Vector episomal

23 Sistema de recombinación homólogaFlp-in Invitrogen: Recombinación sitio específica de Saccharomyces cerevisiae Sitio FRT (Flp recombination target) Recombinasa Flp

24 Vector que contiene el sitio FRT

25 Pasos de recombinación homóloga1- Generar línea que posea el sitio FRT

26 Vector de clonado del gen de interés

27 Vector de clonado del gen de interés

28 Vector de expresión de la recombinasa

29 2- Cotransfectar con vector con gen de interés y vector de expresión para recombinasa

30 Resultado

31 Disminuir expresión de un genRibozimas cDNA aaaaa auucg ccguuua---- ----uaagc-- ggcaaau---- ribozima Clivado del mRNA blanco

32 Disminuir expresión de un genAntisentido 1-Oligonucleótido pequeño simple cadena ( bases) gttagccggggaagcaaat caaucggccccuucguuua---- aaaaa Degradación por RNAsa del híbrido RNA/DNA

33 2- Síntesis de un RNA antisentido complementario al gen blanco.cDNA a’ b’ c’ aaaaaa 5’ 3’ mRNA a b c Degradación por RNAsa del híbrido RNA/RNA

34 Disminuir expresión de un gen

35 Síntesis in vitro • Síntesis química • Transcripción in vitro • Digestión de los dsRNA por RNase III/DICER Expression in vivo • Plásmidos • Templados para PCR (cassette de expresión siRNA) • Vectores virales

36 RNAi (siRNA) ----------------caaucggccccuucguuua---- aaaaa SíntesismRNA Síntesis guuagccggggaagcaaau auuugcuuccccggcuaac RNAi (30 a 50 nucleotidos) b) cDNA Procesados por la maquinaria celular (dicer…) Degradación por RNAsa Clivado del mRNA blanco

37 Estrategias siRNA

38 Expresión de siRNA in vivoPromotor/Enhancer • Pol III (U6, H1) • Pol II (CMV) Secuencia de terminación • Pol III: string of 3-5 T’s) Señal de poly(A) SV40 siRNA Templado Templado para cadenas sense , hairpin y antisense del siRNA

39 Vector siRNA

40 Vectores Plasmídicos Expresión transiente • No se trabaja con RNA • Produce gran cantidad de vector • Enriquecimiento de células transfectadas por sorting o selección Expresión Estable (marcadores de selección) • Produce líneas estables • Animales transgénicos

41 Vectores múltiples siRNA

42 Vectores múltiples siRNA

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44 Control siRNA

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46 Bibliotecas siRNA

47 Diseño del experimento

48 Diseño del experimento

49 Bibliotecas siRNA: ejemplo

50 Bibliotecas siRNA: ejemplo

51 Bibliotecas siRNA: ejemplo