1 Transferencia de material genético IIAislamiento de plásmidos

2 Objetivos Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico y su separación del DNA Realizar el aislamiento de DNA plasmídico

3 Estructura del ADN James Watson y Francis Crick en demostraron que la estructura del ADN consiste en una doble hélice formada por dos cadenas.

4 DNA

5 DNA La extensión de DNA que tiene cada organismo no es la misma.El DNA a pesar de su extensión tiende a formar una estructura helicoidal compacta.

6 Estructura del DNA Doble hélice Estabilizada por puentes de hidrógenoEn la célula generalmente superempacada o superenrollada

7 Conformaciones de un plásmidoLinealizado: Es decir cuando se ha cortado ambas cadenas del DNA sólo una vez. Parcialmente linealizado: Cuando se ha cortado el DNA en una de las cadenas DNA relajado circular. DNA que no se ha empacado. Superenrrollado: Covalentemente cerrado y muy empacado Superenrollado desnaturalizado. Parecido al anterior pero un poco menos empacado

8 Conformaciones distintas del DNA: Superenrollamiento

9 Pero como vemos el superenrollamiento?Abierto Relajado Superenrollado El superenrollado es más compacto y por tanto migra más rápido en el gel

10 ¿Cómo afecta el superenrollamiento del DNA a la función de la célula?Induce cambios locales en el DNA que desestabilizan la doble cadena y esto afecta la transcripción o cambia la unión de proteínas al DNA. Induce cambios globales en el DNA, los cual hace que secuencias de DNA distantes se acerquen y facilita la compactación del DNA y la recombinación sitio específica

11 Puentes de hidrógeno en el DNADNA estructura helicoidal Estructura estabilizada por puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas (A=T; G≡C) Superenrollamiento Desnaturalizar- Renaturalizar: Romper y rehacer puentes de hidrógeno

12 DNA se puede desnaturalizarCalor, pH,↑ iones se eliminan sus puentes de hidrógeno.

13 EFECTO HIPERCRÓMICO Al monitorear su absorbencia a 260 m se observa que hay un aumento en está conforme alteramos o despegamos la doble hélice EFECTO HIPERCRÓMICO

14 Tm Temperatura a la cual el 50% del DNA se encuentra en la forma desplegada.

15 La re-naturalización El DNA se puede volver a re- naturalizar.Hay que hacerlo en condiciones suaves para que el apareo de bases sea el correcto. De no ser así se pueden producir agregados fácilmente precipitables.

16 Obtención del plásmidoPaso 1: Lisis celular Generalmente se realiza con detergentes lleva detergentes para solubilizar la membrana

17 Obtención del plásmidoPaso 2: Precipitación de proteínas y desnaturalización del DNA Se perturban los puentes de hidrógeno entre cadenas Se añade generalmente NaOH

18 Obtención del plásmidoPaso 3: Renaturalización del DNA Se neutraliza el pH de la solución y se renaturaliza el DNA, PERO NO TODO!!!

19 Fundamento Lisis alcalinaCuando los puentes de hidrógeno entre las cadenas complementarias del DNA plasmídico circular se rompen, ya sea por calentamiento o por un pH alcalino, las cadenas permanecen cercanas ya que el enrollamiento de las dos cadenas no se ha perturbado grandemente. En contraste, las cadenas lineales o rotas de DNA cromosomal se renaturalizan rápidamente ya sea por enfriamiento o al restaurar el pH neutro de la solución y la fidelidad de la reasociación es substancialmente diferente para ambas macromoléculas.

20 Continuación... Paso 4: Separación del DNA cromosomal del DNA plasmídico y su purificación El DNA cromosomal está agregado y al centrifugar se queda en el botón El DNA renaturalizado se queda en la solución, el sobrenadante

21 El experimento

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23 Cuantificación Una vez que se tenga el plásmido purificado entonces:Correr una muestra en un gel de agarosa Medir la absorbancia a 260 nm. Estimar la concentración. Guardar a –20°C para usar en la próxima sesión

24 Siguiente sesión experimentalContinuamos con: Ensayo de restricción (2 h incubación de DNA con enzimas) Corrimiento electroforético: Gel de agarosa (aprox 45 min) Inducción de proteína recombinante (Alcanzar DO 0.6 en 1.5h; inducción 1.5h) Corrimiento electroforético: Gel de poliacrilamida (45 min) Siguiente sesión experimental

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26 Preparación de un gel de agarosa para el corrimiento electroforético del plásmido y los productos de restricción