1

2 Typy analiz z wykorzystaniem mikromacierzyEkspresja genów Detekcja mutacji i polimorfizmów Genotypowanie (SNP)

3 Dwie platformy badań mikromacierzowychMikromacierze oligonukleotydowe Mikromacierze cDNA

4 Eksperyment na dwóch platformach badan mikromacierzowych

5

6 Charakterystyka sond stosowanychdo konstrukcji mikromacierzy Komplementarne do konca 3’ transkryptu Bez sekwencji palindromowych Unikatowe czesci danego transkryptu do selektywnego rozróznienia transkryptów niewiele rózniacych sie od siebie: •Geny blisko spokrewnione ze soba •Geny z jednej rodziny genowej •Warianty alternatywnego skladania mRNA

7 Podłoża mikromacierzySztywne Podatne na chemiczne modyfikacje powierzchni Roztwór sondy nie powinien wnikac w podloze ani dyfundowac w nim O niskiej fluorescencji Plastik, szklo pokryte polilizyna lub aminosilanem Podloza pokryte nitroceluloza, nylonem, zelem, filtry nylonowe Modyfikacje powierzchni podloza w celu zwiekszenia zdolnosci absorbowania sondy

8 Techniki nanoszenia sond na mikromacierzTechniki kontaktowe Narzedzia: igly, pincety, kapilary Objetosc nanoszona na powierzchnie od kilku do wielu nanolitrów Srednica punktu µm Techniki bezkontaktowe Ink-jet Z wysoko rozdzielcza strzykawka polaczona z mikrosolenoidowym zaworem

9

10 Nanoszenie sond na powierzchnie mikromacierzy

11 Synteza fotolitograficzna in situ sond oligonukleotydowych typu GeneChip Affymetrix

12

13 Błędy na różnych etapach eksperymentuNanoszenie próbek; różna wydajność nakładania mechaniczne zużycie końcówek różne temperatury i wilgotność PCR różna wydajność Przygotowanie sond odwrotna transkrypcja i znakowanie są etapami które trudno kontrolować degradacja RNA

14 Błędy na różnych etapach eksperymentuPrzygotowanie podłoża Skanowanie i analiza danych inna częstość znakowania przez różne barwniki fluorescencyjne wysycenie pomiaru lokalizacja próbek

15

16 Zliczanie pikseli

17

18

19

20

21 Różne barwniki - różne intensywności

22

23