1 Uniwersytet WarszawskiGenetyka ogólna wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii

2 Gen to odcinek DNA odpowiedzialny za kodowanie funkcjonalnego produktu.W genomie występuje szereg sekwencji nie będących genami. Mitochondria i chloroplasty mają własne genomy.

3 Sekwencjonowanie DNA Technika terminacji łańcucha (dideoksy)

4 Sekwencjonowanie DNA Elektroforeza DNApole elektryczne - DNA się porusza żel stawia opór proporcjonalny do wielkości cząsteczki małe cząsteczki DNA wędrują szybko, duże wolno prążki - grupy cząsteczek o identycznej długości autoradiogram rozdzielonych w żelu reakcji sekwencjonowania DNA

5 Sekwencjonowanie DNA Co zrobić, aby zsekwencjonować DNA?uzyskać właściwą matrycę wybrać startery reakcję i rozdział zlecić wyspecjalizowanemu laboratorium przeanalizować uzyskane wyniki

6 Sekwencjonowanie genomówGłówny problem: reakcja sekwencjonowania sięga tylko do 1000 pz startery wewnętrzne lub DNA pocięty na krótkie fragmenty jak ustalić kolejność krótkich sekwencji? jak zsekwencjonować sekwencje repetytywne?

7 Sekwencjonowanie genomówMetoda shotgun losowa fragmentacja DNA wybór fragmentów o odpowiednej wielkości wstawianie do wektora sekwencjonowanie składanie sekwencji w komputerze

8 Zsekwencjonowane genomyOrganizmy o zsekwencjonowanych genomach (listopad 2004) 66 prokariotycznych w tym szereg chorobotwórczych wszystkie główne organizmy modelowe niektóre rośliny użytkowe człowiek

9 Podsumowanie Gen to odcinek DNA odpowiedzialny za kodowanie funkcjonalnego produktu. W genomie występuje szereg sekwencji nie będących genami. Mitochondria i chloroplasty mają własne genomy. Genomy wielu organizmów są zsekwencjonowane.

10 Regulacja ekspresji genówWykład 7 Regulacja ekspresji genów po co regulować ekspresję genów? jakie są mechanizmy regulacji ekspresji genów? na jakich poziomach ekspresja genów jest regulowana

11 Regulacja ekspresji genówZnaczenie regulacji ekspresji genów rozwój i różnicowanie odpowiedź na warunki środowiska procesy chorobowe wydajność organizmów użytkowych

12 Regulacja ekspresji genówPoziomy na których ekspresja genów jest regulowana dostęp do DNA inicjacja transkrypcji terminacja transkrypcji splicing stabilność RNA inicjacja translacji transport białka cięcie białka modyfikacje posttranslacyjne białka degradacja białka

13 Dostęp do DNA Struktura nukleosomowa chromatynyDNA jest nawinięty na rdzenie z histonów H2A, H2B, H3 i H4 struktury wyższego rzędu

14 Dostęp do DNA Regulacja struktury nukleosomowej chromatynyeuchromatyna i heterochromatyna - obszary o strukturze rozluźnionej lub zagęszczonej przesuwanie nukleosomów - zwalnianie dostępu do miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych elementy jądra komórkowego

15 Dostęp do DNA Znaczenie struktury chromatyny dla uzyskiwania organizmów transgenicznych miejsce integracji transgenu w genomie silnie wpływa na poziom ekspresji sekwencje modyfikujące strukturę chromatyny mogą niwelować efekt pozycyjny

16 Dostęp do DNA Metylacja DNA przyłączenie grupy metylowej do cytozynypowoduje zamknięcie danego obszaru chromatyny może być podtrzymywana podczas podziałów komórkowych metylacja DNA a struktura chromatyny metylotransferaza DNA podtrzymywanie metylacji DNA

17 Inicjacja transkrypcjiAlternatywne czynniki sigma u E. coli 70 - wariant główny 54 - rozpoznaje geny metabolizmu azotu 32 - rozpoznaje geny aktywowane w wysokiej temperaturze S - rozpoznaje geny stacjonarnej fazy wzrostu F - rozpoznaje geny kodujące białka wici E - rozpoznaje geny kodujące białka wydzielane na zewnątrz komórki FecI - rozpoznaje geny kodujące białka transportu żelaza

18 Inicjacja transkrypcjiOperon laktozowy przykład mechanizmu regulacji transkrypcji LacI sekwencje o nieznanej funkcji mutacja (lacI-) LacZ aktywny również przy braku laktozy LacZ gen kodujący enzym -galaktozydazę ekspresja indukowana przez laktozę mutacja (lacZ-) brak zdolności rozkładania laktozy Pytanie: czy LacI to czynnik cis czy trans?

19 Inicjacja transkrypcjiOperon laktozowy wiemy że: mutacja (lacI-) - LacZ aktywny również przy braku laktozy pytanie: czy LacI działa w cis czy w trans? LacI LacZ LacI LacZ działanie cis działanie trans LacI to sekwencja regulatorowa LacZ mutacja lacI- powinna być dominująca LacI produkuje czynnik regulujący aktywność LacZ mutacja lacI- powinna być recesywna T6S Pro+ lacI- LacZ+ x T6R pro- LacI+ lacZ- fenotyp: ekspresja LacZ indukowana wniosek: LacI działa w trans

20 Inicjacja transkrypcjiOperon laktozowy wiemy że: mutacja (lacI-) - LacZ aktywny również przy braku laktozy wiemy że: LacI działa w trans pytanie: czy LacI koduje aktywator czy represor? aktywator represor - laktoza niezwiązany związany + laktoza związany niezwiązany co robi aktywuje hamuje mutant aktywny nieaktywny LacI+ LacZ+ x lacI- lacZ- aktywność LacZ -laktoza +laktoza lacI- lacZ lacI- lacZ- LacZ+ + + lacI- lacZ- LacZ+ LacI+ - + wniosek: LacI koduje represor

21 Inicjacja transkrypcjiOperon laktozowy - budowa i zasada działania

22 Inicjacja transkrypcjiRegulacja inicjacji transkrypcji u Eucariota bardziej rozbudowane sekwencje regulacyjne przykład: czynniki transkrypcyjne będące receptorami hormonów sterydowych Procariota Eucariota

23 Terminacja transkrypcjiWybór miejsca terminacji antyterminacja - regulacja ekspresji dalszych genów operonu atenuacja - regulacja genów biosyntezy aminokwasów antyterminacja atenuacja

24 Splicing Alternatywny splicing omijanie lub pozostawianie egzonuwycięcie lub pozostawienie intronu wybór egzonu początkowego wybór egzonu kończącego

25 Stabilność mRNA Regulacja stabilności mRNAmechanizm zalezny od deadenylacji sekwencje przyśpieszające degradację interferencja RNA

26 Inicjacja translacji Regulacja inicjacji translacjiregulacja ogólnego poziomu syntezy białek fosforylacja IF regulacja specyficzna synteza białek rybosomalnych u E. coli synteza ferrytyny u ssaków synteza transferyny u ssaków

27 Transport białka Regulacja transportu białek do różnych przedziałów komórki do jądra komórkowego, mitochondriów, plastydów, peroksysomów i retikulum endoplazmatycznego o przeznaczeniu białka decyduje sekwencja sygnałowa w białku sekwencja sygnałowa jest odcinana

28 Cięcie białka Obróbka proteolityczna białka poliproteinyodcinanie końców białka wycinanie fragmentów ze środka białka

29 Modyfikacje posttranslacyjne białkaModyfikacje posttranslacyjne - przyłączenie do białka różnych grup chemicznych zmienia właściwości białka