1 URL = http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3/http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3/ estimas intra- e inter-poblacionales de variabilidad: Gene diversity Mean number of pairwise differences---Nucleotide diversity Theta (2M : M = 2N en diploides) –Hom, S, k, π ( homocigosidad, sitios polimórficos, número de alelos, mean number of pairwise differences) Mismatch distribution Frecuencias haplotípicas H-W equilibrium Test de neutralidad Ligamiento Estructura poblacional (AMOVA) Population pairwise distances (F ST ) Exact test Mantel test ARLEQUIN estimas intra- e inter-poblacionales de variabilidad: Gene diversity Mean number of pairwise differences---Nucleotide diversity Theta (2M : M = 2N en diploides) –Hom, S, k, π ( homocigosidad, sitios polimórficos, número de alelos, mean number of pairwise differences) Mismatch distribution Frecuencias haplotípicas H-W equilibrium Test de neutralidad Ligamiento Estructura poblacional (AMOVA) Population pairwise distances (F ST ) Exact test Mantel test
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3 Fichero de datos: datos27_alu.xls 1)Se prepara una hoja EXCEL: 1ª columna: nombre del HT Siguientes columnas: poblaciones 1ª Fila: abreviaturas de las poblaciones (importan las mayúsculas) 2ª Fila: sample size 3ª y siguientes: HT ó HG ó Alelos Hoja Datos: Fila 2: 27 poblaciones Fila 5: “simple size” = tamaño muestral Columna B: HT = haplotye Columna A: HG = haplogroup Columna D: nombre del HT y del HG Columna C: suma de las filas, usada para eliminar las filas de HT no presentes en las poblaciones elegidas Hoja Original: datos crudos
4 FICHERO DE DATOS- excel - Linea 149: Tabla para estimar las frecuencias absolutas de los HG--- complétela Crear una matriz con las frecuencias absolutas de cada HG - Comprobamos que todo es correcto. Para ello creamos las filas 173 (suma de los valores de cada HG) y 174 (diferencia entre éstos y los tamaños muestrales) - Si todo está correcto, transformamos las fórmulas en valores. Para ello: Copiamos las filas de la 149 a la 172 y las insertamos en la fila 176: Botón derecho—pegado especial—valores—aceptar. - Comprobar que no ha habido errores creando una matriz en la línea 226 que sea la diferencia entre los valores que acabas de pegar y los que están en la matriz verde.
5 FICHERO DE DATOS de texto.arp SECCIONES-APARTADOS Hay apartados obligatorios y apartados optativos [Profile] Title=“ “ NbSamples = # nº del 1 al 1000 DataType = DNA frequency, RFLP, Standard, Microsat GenotypicData = 0 0 = haplotypic 1 = genotypic data Se prepara el archivo en el word, pero salvándolo como texto y la extensión.arp NOTA: en el nombre nbo deben haber espacios.
6 FICHERO DE DATOS de texto.arp SECCIONES-APARTADOS LocusSeparator = WHITESPACE TAB, NONE, cualquiera excepto # y missing data GameticPhase = 1 0 = desconocida, 1 = conocida RecessiveData = 0 0 = codominante, 1 = recesivo MissingData = ‘?’ cualquiera entre únicas ó dobles comillas Frequency = ABSABS (absolutos) ó REL (relativos = frecuencias) CompDistMatrix = 0 0=usa la especificada (Dist), 1= la computa (HT) FrequencyThreshold =1e-5nº de digitos para freq de HT (0.01 a 1e-7) EpsilonValue =1e-7 criterio de convergencia para los algoritmos EM (frecHT y desequilibrio) OPCIONALES
7 FICHERO DE DATOS de texto.arp SECCIONES-APARTADOS [Data] [[HaplotypeDefinition]] HaplListName = “nombre” HaplList = { H1ATCG H2ATCA } También podemos escribirlo: [[HaplotypeDefinition]] HaplListName = “nombre” HaplList = EXTERN “hapl_file.hap”
8 FICHERO DE DATOS de texto.arp SECCIONES-APARTADOS [Data] [[DistanceMatrix]] MatrixName = “nombre” MatrixSize =# nº líneas = nº OTUs, sec.,... MatrixData = { H1 H2 H3 identificadores OTUs, sec.,... 0.00000 2.00000 0.00000 3.00000 2.00000 0.0000 } También podemos escribirlo: [[DistanceMatrix]] MatrixName = “nombre” MatrixSize =# MatrixData = EXTERN “mat_file.hap”
9 FICHERO DE DATOS de texto.arp SECCIONES-APARTADOS [Data] [[Samples]] SampleName = “nombre” SampleSize = #nº entero = tamaño muestral SampleData = { H11 tb se puede poner la definición del HT aquí H25 si usanmos FREQUENCY, sólo ID y # } se repite tantas veces como muestras tengamos. Si se trata de genotipos: SampleData = { H11 ATTCGCGATTCG ATTCGCAATTCA H25 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 }
10 FICHERO DE DATOS de texto.arp SECCIONES-APARTADOS [Data] [[Structure]] StructureName = “nombre” NbGroups = #nº entero = tamaño muestral IndividualLevel = 01 si tenemos datos genotípicos Group = { population } se repite tantas veces como muestras tengamos. Recordatorio: # indica que no se lee esa línea, pero nunca puede ir entre dos {}
11 FICHERO DE DATOS de texto.arp SECCIONES-APARTADOS [Data] [[Mantel]] MatrixSize = # MatrixNumber = 2 si ponemos 3, tenemos que definir 2 DistMatMantel, para que correlacione Y con estas dos X YMatrix =“fst”, “log_fst”,slatkinlinearfst”, “log_slatkinlinearfst”, “nm” “custom” es decir, matriz de distancias genéticas YMatrixLabels = { “population” “population”... } DistMatMantel = { 0.00 3.20 0.00 0.00 0.76 0.00 } UsedYMatrixLabels = { “population” “population”... si queremos definir un subgrupo }
12 FICHERO DE DATOS de texto.arp [Profile] Title="AMOVA, 27 poblaciones, HG" NbSamples=27 DataType=FREQUENCY GenotypicData=0 Frequency=ABS [Data] [[Samples]] SampleName="GAL" SampleSize=191 SampleData= { HG0139 HG0274. } [[Structure]] StructureName="regiones" NbGroups=5 IndividualLevel=0 Group={ "GAL" "AST" } [Profile] Title="" NbSamples= DataType= GenotypicData= Frequency= [Data] [[Samples]] SampleName="" SampleSize=# SampleData= { HG0139 HG0274 } [[Structure]] StructureName="regiones" NbGroups=5 IndividualLevel=0 Group={ "" }
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14 Uso del ARLEQUIN Open Project---Buscar el archivo ---ABRIR
15 Uso del ARLEQUIN Nos da la información del proyecto y vamos a la pestaña SETTINGS
16 Uso del ARLEQUIN Aspecto de la pestaña SETTINGS
17 Uso del ARLEQUIN Marcamos AMOVA y luego, Standard AMOVA
18 Uso del ARLEQUIN POPULATION COMPARISONS Compute pairwise FST ---- Slatkin’s distance Como no le dimos datos moleculares: Use conventional F-statistics (haplotype frequencies only)
19 Uso del ARLEQUIN POPULATON DIFFERENTIATION --- Exact test of population differentiation
20 Uso del ARLEQUIN MOLECULAR DIVERSITY INDICES --- Standard diversity indices
21 Uso del ARLEQUIN START
22 Uso del ARLEQUIN Computations are over File---close projec --- cerrar
23 FICHERO DE SALIDA Crea una carpeta con el nombre de tu archivo y introduce 5 ficheros: amovaHG27_sB.htm amovaHG27_sB.js amovaHG27_sB_main.htm amovaHG27_sB_tree.htm Arlequin_log.txt (avance del proceso) Y otro externo con los datos usados: randseed.txt Usamos amovaHG27_sB.htm que lo salvamos como.txt
24 FICHERO DE SALIDA -errores y el día y fecha de la corrida - Información acerca del proyecto y varias secciones ANALYSES AT THE INTRA-POPULATION LEVEL: ======================================================== == Sample : GAL =========================================================== Standard diversity indices : No. of gene copies: 191 No. haplotypes : 19 No. of loci : 0 No. of usable loci : 0 loci with less than 5.00 % missing data No. of polymorphic loci : 0 Haplotype-level computations Sum of square freqs. : 0.2073 Gene diversity : 0.7969 +/- 0.0228 (Standard deviation is for the sampling process) ================================ == Molecular diversity indices : (GAL) ================================
25 FICHERO DE SALIDA -errores y el día y fecha de la corrida - Información acerca del proyecto y varias secciones ANALYSES AT THE INTRA-POPULATION LEVEL: ================================ == Molecular diversity indices : (GAL) ================================ Sample size : 191.0000 No. of haplotypes : 19 Allowed level of missing data : 5.0000 % Number of polymorphic loci : 0 Number of usable loci : 0 Theta(Hom) : 3.104775 º S.D. Theta(Hom) : 0.471907 Theta(k) : 5.056943 95 % confidence interval limits for theta(k) : [ 3.033856, 8.158112 ] Unable to compute theta(S) for standard data type Unable to compute theta(Pi) for standard data type Al no haberla datos moleculares, este apartado no tiene mucho sentido
26 FICHERO DE SALIDA =================================================== == GENETIC STRUCTURE ANALYSIS AMOVA ======================================================
27 List of labels for population samples Population pairwise FSTs FST P values Matrix of significant Fst P values Significance Level=0.0500 Matrix of Slatkin linearized FSTs as t/M=FST/(1-FST) (M=N for haploid data, M=2N for diploid data) Matrix of M values (M=Nm for haploid data, M=2Nm for diploid data) Exact Test of Sample Differentiation Based on Haplotype Frequencies : List of labels for population samples Global test of differentiation among sample Non-differentiation exact P values FICHERO DE SALIDA =================================================== == Comparisons of pairs of population samples ======================================================
28 Podemos paras los datos (FST y exact test) a un excel para poder mover filas y columnas
29 OTRAS POSIBILIDADES Datos moleculares No solo podemos usar los HT ó HG de un marcador haploide. Podemos hacer uso de más información. Por ejemplo: si usamos los HT para comparar las poblaciones podríamos usar la divergencia (medida, por ejemplo, por el número de diferencias) molecular entre ellos, para ponderar las diferencias. Esta información se la podemos dar de dos maneras: A) Suministrándole los haplotipos como datos binarios (cada RFLP ó cada SNP ó cada base, sería una posición) Ahora, dentro de la sección DATA hemos incluido el apartado: [[HaplotypeDefinition]] HaplListName="56 human mtDNA RFLPs" HaplList= EXTERN "56hapdef1.txt" Que nos indica las diferencias moleculares entre los distintos HT
30 FICHERO DE DATOS de texto.arp SECCIONES-APARTADOS [Data] [[HaplotypeDefinition]] HaplListName = “nombre” HaplList = { H1ATCG H2ATCA } También podemos escribirlo: [[HaplotypeDefinition]] HaplListName = “nombre” HaplList = EXTERN “hapl_file.hap”
31 Ahora existe la posibilidad de calcular los FST basados sólo en las frecuencias o pedirle que nos “compute distance matriz” usando “pairwise differences” También le podemos pedir: - que nos imprima la matriz de distancia entre los HT - los índices moleculares de diversidad: Theta RESULTADOS: El nº de loci: posiciones que le hemos puesto Mean number of pairwise differences, equivalente a pi y te da las diferentes Theta, basadas en Homocigosis, nº alelos, nº sitios polimórficos y pi
32 B) También podemos darle directamente la matriz de diferencias entre los HT, incluyendo en DATA el apartado: [[DistanceMatrix]] MatrixName="A matrix of genetic distance between 56 haplotypes" MatrixSize= 56 #LabelPosition=LINE MatrixData=EXTERN "amovadis.dis“ Para ello vamos a usar el programa HAPLOSITE http://www.haplosite.com/haplosearch http://www.haplosite.com/haplosearch
33 HAPLOSEARCH http://www.haplosite.com/haplosearch http://www.haplosite.com/haplosearch Tenemos que crear un archivo con el siguiente formato: START: 090 >CRS TATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCATAA ATACTTGACCACCTGTAGTACATAAAAACCCAATCCACATCAAAACCC CCTCCCCATGCTTACAAGCAAGTACAGCAATCAACCCTCAACTATCAC ACATCAACTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACCCACTAGGATACCAA CAAACCTACCCACCCTTAACAGTACATAGTACATAAAGCCATTTACCGT ACATAGCACATTACAGTCAAATCCCTTCTCGTCCC >SEQ5 093 >SEQ6 094
34 Esto lo hacemos a partir del excel: A)Nosotros hemos analizado entre las posiciones 65 y 365, por lo que en la primera línea tenemos que poner START: 065 B) Ahora preparamos la sec. del CRS, para ello abrimos el archivo RE_rCRS.txt y seleccionamos de la posición 16065 a la 16365. Cuando ya lo tenemos sin espacios, sin marcas de párrafo y en mayúsculas, lo añadimos a la segunda fila como >CRS^pSecuencia en mayúsculas^p HAPLOSEARCH C) Ahora en las restantes filas escribimos >H#^p”motivo HT”^p. - Para ello creamos el excel, lo copiamos y convertimos la tabla en texto: sustituimos ^p por ^p> - reemplazamos 2 espacios por uno (tantas veces como necesario) - reemplazamos ^t por ^p - revisamos que no queden espacios al final de las posiciones de los HT, reemplazamos espacio^p por ^p - lo salvamos como.txt (texto sin formato)
35 D) lo corremos en el programa http://www.haplosite.com/haplosearchhttp://www.haplosite.com/haplosearch Procesar, examinar, get sequence, populations genetics, procesar. - Esperar---abrir con WORDPAD, aceptar, Guardar como “sec_amova27_rosi.txt” E) preparar la matriz para el arlequín, cuyo formato es:: [Data] [[HaplotypeDefinition]] HaplListName="U3" HaplList={ H01.. TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA^p H02.. } HAPLOSEARCH
36 FICHERO DE DATOS de texto.arp SECCIONES-APARTADOS [Data] [[HaplotypeDefinition]] HaplListName = “nombre” HaplList = { H1ATCG H2ATCA } También podemos escribirlo: [[HaplotypeDefinition]] HaplListName = “nombre” HaplList = EXTERN “hapl_file.hap”
37 Pasos: - Copiamos sec_amova27_rosi.txt como matriz.txt - Quitamos la 1ª fila - reemplazamos > por nada - reemplazamos ^p por 3 espacios - reemplazamos 3espaciosH por ^pH - quitamos el CRS y salvamos. Ahora introducimos en amova_HT135_mol.arp el encabezado y la matriz En DataType ponemos DNA y añadimos: LocusSeparator=none CompDistMatrix=1 Si está bien se te activaran los “Molecular diversity indices” NOTA: Tambien existe la posibilidad de usar un archivo externo, ver los modelos del arlequin FICHERO DE DATOS de texto.arp
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