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2 v = c/l E = hv

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20 S2 S1 Energía S0 Diagrama de Jablonski Conversión interna (10-12 s)Absorción (10-15 s) Fluorescencia (10-9 s-10-8 s) Nr S0 Corrimiento de Stokes : emisión > absorción

21 Relajación del solventeDiagrama de Jablonski Conversión interna S2 Relajación del solvente (10-10 s) (10-12 s) S1 Energía Absorción (10-15 s) S0 Corrimiento de Stokes : emisión > absorción

22 Absorción G relajación térmica relajación térmica Fluorescencia

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33 Quantum yield

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36 Tiempo de vida

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38 Quenching the fluorescenciaPuede ser estático o dinámico

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41 Resonance Energy Transfer

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46 FLUORÓFOROS INTRÍNSECOSTriptofano es el fluoróforo intrínseco dominante. Trp es muy sensible al entorno. Es posible ver cambios en los espectros de emisión en respuesta a cambios conformacionales, asociación de subunidades, unión de sustratos, desnaturalización y cualquier cosa que afecte el entorno local del anillo indol. Trp es muy sensible a la atenuación colisional, tanto por grupos externos como por grupos vecinos, en la proteína. Trp puede ser excitado selectivamente a 295 nm. (para evitar la excitación de la Tyr).

47 Trp 48 Azurina 4AZU max= 308nm Trp 48 Proteína G max= nm Trp 25 Glucagon 1GCN max nm

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57 Fluoróforos extrínsecos* fluorescencia (no polar) absorción _ + et Transferencia electrónica S1 ct S0 np (estable en ambiente polar) fluorescencia (ambiente polar) S1 (no polar) Variación en el rendimiento cuántico del ANS

58 U ESβL9 (5 M GdmCl)  IP ESβL9  N ESβL9 (0.05 M GdmCl)N-terminal C-terminal Esquema de la estructura de la ‑lactamasa. Se muestran las hélices C y N terminales.

59 Longitud de onda Fluorescencia