1 VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS Depto. de Ciencias Básicas – UFROProf. Dr. Luis Salazar N. Depto. de Ciencias Básicas – UFRO 2004

2 ¿Qué características tengo que considerar cuando selecciono un método para incorporarlo a la rutina del laboratorio?

3 Se debe considerar: Uso que se le dará (rutina, confirmatorio)Nº de tests a realizar Instrumentación requerida Sensibilidad, especificidad, exactitud y precisión Costo Tipo de muestra Tipo de analito Seguridad Aceptación internacional y científica Que no sea obsoleto

4 DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DEL ENSAYOFases que debe pasar un kit antes de poder ser comercializado o empleado en el laboratorio DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DEL ENSAYO VALIDACIÓN ANALÍTICA VALIDACIÓN CLÍNICA

5 ¿Cuándo es necesario validar?Cuando se está desarrollando una técnica nueva. Antes de incorporar una nueva técnica a la rutina del laboratorio. Cuando se desea comparar el desempeño de dos técnicas.

6 VALIDACIÓN “La validación de un método analítico es un proceso de evaluación sistemático para demostrar que el método cumple con los requisitos necesarios para el uso que se le va a dar”.

7 ¿QUÉ ES LA VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO?Validación es la confirmación mediante examen y aporte de evidencia objetiva de que se cumplen los requisitos particulares para el uso específico previsto (ISO 8402, ISO 17025). La validación debe ser tan exhaustiva como sea necesario para responder a las necesidades de la aplicación en cuestión. La validación puede incluir procedimientos para el muestreo, manejo y transporte de muestras.

8 VALIDACIÓN ANALÍTICA Estudia los parámetros de desempeño analítico del método: Precisión Exactitud Especificidad Límite de detección Límite de cuantificación Linealidad e intervalo de linealidad Robustez

9 Validación MetodológicaEspectro de absorción Estabilidad de la reacción de color Linealidad Límite de dilución Recuperabilidad Sensibilidad Límite de detección Validación Estadística Precisión Exactitud VALIDACIÓN ANALÍTICA

10 VALIDACIÓN METODOLÓGICA

11 LINEALIDAD Es la capacidad de producir resultados proporcionales a la concentración del analito en las muestras dentro de un rango determinado de concentración ya sea directamente o por medio de una transformación matemática bien conocida. Se analizan muestras de concentraciones conocidas o series de muestras diluidas en al menos 5 niveles de concentración. Repetir 3 veces en forma independiente Se grafican los datos resultantes en el eje y y los valores conocidos o esperados en el x. NCCLS (The National Committee for Clinical Laboratory Standards) recomienda un mínimo de 4 y preferentemente 5 diferentes niveles de concentración. Se recomienda realizar 4 medidas o replicados de cada muestra o pool.

12 INTERVALO DE LINEALIDAD Y LÍMITE DE DILUCIÓNRango de Linealidad: 0 – 10 g/dL Límite de Dilución: 10 g/dL g/dL Rango de linealidad: intervalo entre las concentraciones más baja y más alta de analito determinadas, para las cuales se cumple la ley de Beer.

13 Curvas de calibración

14 Errores de una calibración inadecuada

15 DESVIACIONES DE LA LEY DE BEER RADIACIÓN POLICROMÁTICA

16 RECUPERABILIDAD Capacidad de un método de determinar todo el analito presente en la muestra, según el alcance del método (algunos solo determinan algunas especies del analito). La mejor manera de determinar la eficacia de extracción del método es adicionar diferentes concentraciones del analito a las muestras y procesarlas por el método completo.

17 Aunque es la manera más común de cuantificar la recuperación, el analito adicionado puede no enlazarse tan fuertemente a la matriz como el presente de manera natural y dar como resultado la impresión de una elevada eficacia de extracción. La alternativa es efectuar el proceso con MR en la matriz deseada, si existen; si estos MR han sido generados mediante caracterización de muestras naturales el estudio de recuperación representará con mayor precisión la extracción de muestras reales.

18 ENSAYO DE RECUPERACIÓNTambién llamado de adición estándar. Se puede llevar a cabo de dos maneras: con placebo o con muestra, que se enriquece con estándar. Realizar las medidas por triplicado. Criterio de Aceptación % de recuperación obtenido entre %

19 SENSIBILIDAD La sensibilidad se refiere a la respuesta obtenida para una determinada cantidad de analito. También se indica mediante dos factores analíticos: El Límite de Detección (LOD). El Límite de Cuantificación (LOQ).

20 LÍMITE DE DETECCIÓN (LOD)Es la concentración más baja del analito que se puede detectar pero no necesariamente cuantificar. En general, es el punto al que la señal del analito es igual a tres veces el ruido de la medida. Para algunos espectrofotómetros se puede establecer que el LOD es, aproximadamente, tres veces la desviación estándar.

21 LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LOQ)El LOQ es la concentración más baja del analito que se puede determinar con una precisión y exactitud aceptables. Para calcular el LOQ se deben de definir por tanto los límites aceptables de precisión y exactitud. Se puede aproximar a la relación entre la precisión de la medida analítica y la sensibilidad del método.

22 ROBUSTEZ Es una medida de la capacidad de un procedimiento de permanecer inalterado por pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y provee información de su comportamiento en la rutina. Parámetros estudiados: Efectos del congelado- descongelado Tiempos de incubación Temperaturas de incubación Longevidad de los reactivos Preparación de la muestra Conservación de la muestra

23 ESPECIFICIDAD Habilidad de evaluar inequívocamente el analito en presencia de componentes que se puede esperar que estén presentes.

24 INTERFERENCIAS Efecto de una sustancia presente en una muestra que causa que el resultado de un test sea erróneo. Puede ser dependiente del analito o independiente del mismo y puede aumentar o disminuir la medida realizada. Son difíciles de detectar. Interferencias Def: el efecto de una sustancia presente en un sistema analítico que causa una desviación del valor medido del valor real , usualmente expresada como concentración o actividad. Puede ser: dependiente del analito o independiente del mismo y puede aumentar o disminuir la medida realizada

25 COMO DETECTAR Y CHEQUEAR INTERFERENCIASSon difíciles de detectar pues se desconoce el resultado verdadero. Se saca de los datos del fabricante o de literatura. Prestar atención a resultados de pacientes con condiciones clínicas asociadas con interferencias (enfermedades hepáticas, fallas renales, embarazo). Incongruencias con cuadro clínico. Inspeccionar las muestras visualmente buscando: hemólisis, ictericia, lipemia o mejor evaluarlas usando índices séricos.

26 FORMAS DE ESTUDIAR LAS INTERFERENCIASTest de dilución lineal (las interferencias no se comportan linealmente con la dilución). Analizar la muestra por otro método (se comportan diferentes). Tratar la muestra para remover, destruir o inhibir sustancias potencialmente interferentes. Análisis de muestras enriquecidas con el interferente.

27 Análisis de muestras enriquecidasSe prepara una muestra agregando el material interferente a una muestra real que contenga el analito. Una segunda alícuota de la muestra original se diluye con un solvente y ambas se analizan determinándose la diferencia entre ambas. EXPERIMENTO DE INTERFERENCIA ·         Se realiza para estimar el error sistemático causado por otros materiales que pueden estar presentes en la muestra a ser analizada. ·         Se preparan un par de muestras para testear por el método en estudio. ·         La primera se prepara agregando una solución del material que se sospecha interferente a una muestra de un paciente que contiene el analito. ·         La segunda se prepara diluyendo otra alícuota de la misma muestra con solvente puro que no contiene el interferente. ·         Se analizan ambas muestras por el método en estudio para ver si hay diferencia en los valores debida al agregado del interferente. Realizar duplicados. ·         Solución del analito: pueden usarse sol. estándar, muestras de pacientes o pooles pero se recomienda duplicar lo más posible la matriz.

28 VALIDACIÓN ESTADÍSTICA

29 PRECISIÓN Expresa el grado de acuerdo entre valores cuando se analiza la misma muestra estable repetidamente. Se habla de Imprecisión. Puede considerarse a tres niveles: Repetibilidad Precisión intermedia Reproducibilidad EXPERIMENTOS DE REPLICACIÓN · Se realiza para estimar la imprecisión o error aleatorio del método. El propósito es observar la variación esperada en el resultado de un test bajo las condiciones de operación normal de un laboratorio. · Estima el error causado por factores como el pipeteo, condiciones de reacción (Tº, mezclado). Suele ser mayor en sistemas no automatizados. · Se emplean los resultados de 20 alícuotas de cada material y se calcula la media, el desvío estándar y el coeficiente de variación.

30 REPETIBILIDAD (REPETITIVIDAD): Precisión obtenida bajo las mismas condiciones de operación en un intervalo corto de tiempo (mismo día), por un mismo analista, en la misma muestra homogénea y en el mismo equipo. PRECISION INTERMEDIA: Precisión obtenida dentro del laboratorio por diferentes analistas, diferentes equipos, días distintos con la misma muestra homogénea. REPRODUCIBILIDAD: Expresa la precisión entre laboratorios como resultado de estudios interlaboratoriales diseñados para estandarizar la metodología.

31 Se estudia mediante experimentos de replicación.El propósito es observar la variación esperada en el resultado de un test bajo las condiciones de operación normal de un laboratorio. Estima el error causado por factores como el pipeteo, condiciones de reacción (Tº, mezclado). Suele ser mayor en sistemas no automatizados.

32 Las muestras de ensayo comúnmente usadas son: soluciones estándar, materiales de control, pooles de pacientes o muestras frescas de pacientes individuales. Se emplean los resultados de 20 alícuotas de cada material y se calcula la media, el desvío estándar y el coeficiente de variación. Período de tiempo que abarca el experimento: Tiempo ideal 20 días.

33 CÁLCULOS: Promedio: Desvío standard : Coeficiente de variación:

34 “Un test exacto es implicitamente específico y preciso”EXACTITUD Expresa la cercanía entre el valor que es aceptado, sea como un valor convencional verdadero (material de referencia interno), sea como un valor de referencia (material de referencia certificado o estándar) y el valor promedio obtenido al aplicar el procedimiento de análisis un cierto número de veces. “Un test exacto es implicitamente específico y preciso”

35 ¿Cómo la determino? A) Comparación con métodos de referencia.B) Análisis de muestras de referencia certificadas. C) Ensayos de recuperación. D) Ensayos interlaboratorios.

36 Comparación con métodos de referenciaSe analizan muestras de pacientes por el método en estudio y otro método de comparación, luego se estima el error sistemático basándose en las diferencias observadas para ambos métodos. El método de comparación debe en lo posible ser el de referencia (“gold standard”). Es una técnica cuyos resultados se han comparado con métodos definitivos y/o trazables a materiales estándar de referencia.

37 Número de muestras a usar Mínimo de 40 para los dos test. Deben elegirse de modo de cubrir todo el rango de trabajo del método y representar el espectro de enfermedades esperadas en la aplicación de rutina del método. Es mejor realizar ensayos de las muestras por duplicado (a partir de dos alícuotas diferentes) en diferentes corridas o por lo menos en diferente orden. Período de tiempo: Mínimo de 5 días, lo ideal 20 días, corriendo 2 a 5 muestras de pacientes por día. Número de muestras a usar Mínimo de 40 para los dos test. Deben elegirse de modo de cubrir todo el rango de trabajo del método y debe representar el espectro de enfermedades esperadas en la aplicación de rutina del método. Si el nuevo método tiene como base un principio diferente es conveniente aumentar el nº a 100 o 150 para establecer la especificidad del método. Es mejor realizar ensayos de las muestras por duplicado (a partir de dos alícuotas diferentes) en diferentes corridas o por lo menos en diferente orden.

38 Análisis de datos: Existe mucha discusión sobre cual es la mejor forma de analizar los datos: A) Graficar los resultados y hacer una inspección visual de los mismos. Cualquier muestra con resultados discrepantes debe ser reanalizada. Para los métodos que se espera coincidan hacer primero un gráfico de “diferencias”. Las mismas deberán oscilar alrededor de la línea del cero. Análisis de datos: Existe mucha discusión sobre cual es la mejor forma de analizar los datos. Graficar los resultados y hacer una inspección visual de los mismos Cualquier muestra con resultados discrepantes debe ser reanalizada para confirmar que la diferencia es real y no se debe a errores en el registro de valores o transposición de muestras. Para los métodos que se espera coincidan hacer primero un gráfico de “diferencias”. Las mismas deberán oscilar alrededor de la línea del cero. Ver el punto sospechoso en el gráfico del ejemplo. Además los puntos tienden a a estar encima de la línea del cero a bajas concentraciones y por debajo a altas sugiriendo que existen errores sistemáticos constantes o proporcionales.

39 En la 2º figura se grafican los resultados obtenidos por los dos métodos uno contra el otro. El propósito aquí es también identificar muestras no coincidentes para reanalizarlas mientras están frescas.

40 Cálculos estadísticos Para la comparación de resultados que cubren un amplio rango analítico lo mejor es el cálculo de la regresión lineal. Permite estimar el error sistemático a más de una concentración de decisión médica. También se puede calcular el coeficiente de correlación r que permite saber si el rango de datos es lo suficientemente amplio para dar buenos estimados de la pendiente y la ordenada en el origen (r > 0.99).

41 B) Análisis de muestras de referencia certificadasSe analiza un mínimo de 3 concentraciones y 5 determinaciones por el método a validar y se compara el resultado obtenido con el valor verdadero declarado. Criterio de aceptación: El valor medio debe estar dentro del 15% del valor nominal excepto en el Límite de cuantificación (LDC) que puede ser el 20%.

42 VALIDACIÓN CLÍNICA

43 Validación Clínica La toma de decisiones clínicas es un proceso extremadamente complejo en el que deberá finalmente ser valorada la utilidad de la prueba diagnóstica para el manejo del paciente. Debo conocer la exactitud, es decir, su capacidad para clasificar correctamente a los pacientes en categorías o estados en relación con la enfermedad (típicamente dos: estar o no estar enfermo, respuesta positiva o negativa a la terapia).

44 Diseño de los estudios de Validación clínicaEn el diseño debe considerarse: Intervalos de referencia o rangos normales. Existe diferencia con la edad, sexo u otro factor? Pueden usarse valores de literatura?. Valores de cut off o umbral de decisión: pueden usarse los generalmente aceptados?.

45 Selección de las muestrasDebe tomarse una porción que sea representativa de la población total. Idealmente deben elegirse los sujetos por un proceso al azar para evitar sesgos.

46 Análisis de las muestrasPara evitar sesgos el ensayo debe hacerse a ciegas, es decir sin que el laboratorista sepa la condición clínica del paciente. Si se comparan varios test en el mismo estudio, deben hacerse todos los test en todos los sujetos y en el mismo punto del curso de su enfermedad.

47 Evaluación del desempeñoSensibilidad: Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo cuyo estado real sea el definido como positivo respecto a la condición que estudia la prueba, razón por la que también es denominada fracción de verdaderos positivos (FVP).

48 Especificidad: Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo cuyo estado real sea el definido como negativo. Es igual al resultado de restar a uno la fracción de falsos positivos (FFP)

49 Prevalencia: Indica la proporción de sujetos en la población estudiada que realmente tienen la enfermedad.

50 Un test perfecto tiene S y E de 100%.En realidad existe un par S-E para cada umbral o nivel de decisión. Hay que decidir que par S-E funciona mejor para las circunstancias en que quiero usar el test.