1 Współczesne metody analiz genetycznychAnna Jakubowska Katedra Onkologii Zakład Genetyki i Patomorfologii PUM

2 Genom Chromosom Gen Gen Region międzygenowy

3 Poznanie genomu człowiekarozpoczęcie HGP – (Human Genome Project) wstępny opis sekwencji – 2000 (Venter et al., Science 2001; Lander et al., Nature 2001) zakończenie sekwencjonowania – 2003 oficjalne zakończenie HGP – (International Human Genome Sequencing Consortium, Nature 2004 )

4 Struktura genomu człowiekapz ~ 2% to sekwencje kodujące genów kodujących białka 8 483 genów kodujących RNA pseudogenów ~ 98% to sekwencje niekodujące introny oraz sekwencje międzygenowe SNPs (polimorfizmy pojedynczego nukleotydu) ~ regionów CNV (duplikacje lub delecje odcinków DNA o długości >500 zasad) (http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/StatsTable)

5 Geny funkcja wielu genów wciąż niepoznanaidentyfikacja genów lub specyficznych stref genetycznych związanych z rozwojem chorób: badania asocjacyjne sekwencjonowanie genomu

6 Badania asocjacyjne analiza wybranych markerów –kandydatówanaliza markerów pokrywających cały genom, tzw. GWAS (Genome – Wide Association Study) potocznie nazywana skanowaniem genomu

7 GWAS Badanie „przypadek - kontrola” („case - control”), w którym analizuje się związek pomiędzy występowaniem określonej cechy klinicznej a SNPs lub CNVs rozmieszczonymi w całym genomie A B C A B B B C A C SNP CNV

8 Założenia GWAS badanie dużej liczby polimorfizmów o największej zmienności międzyosobniczej badanie jak największej grupy osób chorych i zdrowych

9 Identyfikacja SNP związanych z chorobąChorzy Zdrowi DNA DNA Porównanie Identyfikacja SNP związanych z chorobą

10 Badania GWAS – kluczowe zasadyhomogenność grupy badanej pod względem analizowanej cechy liczna grupa kontrolna oraz badana walidacja

11 Etapy GWAS Przypadki i kontrole Badane SNPs I etap II etap III etapMultistage design for genome-wide association studies. In a multistage design, a large number of SNPs selected to capture most common genetic variations across the genome (genome-wide scan chip) are tested in a relatively small number of cases and controls in a “discovery study.” The SNPs showing the most significant associations with disease risk in the discovery study (e.g., P value from an association test <0.05) are retested in subsequent replication studies including large independent sets of cases and controls. In the example shown in the figure, SNPs with P values <0.001 in a first replication study are retested in a second replication study. SNPs showing strong evidence of an association with disease risk based on data from the three phases (e.g., P value from an association test <10−7) are selected as markers for chromosomal regions likely to contain disease causing variants. Very large studies and stringent statistical criteria are necessary to have sufficient power to detect associations while minimizing the probability of false-positive findings. The selected markers in genome-wide association studies are further evaluated in fine mapping studies to identify causal variants, and in functional studies to understand the biological mechanism of the observed associations with disease. Red and blue individuals represent cases of breast cancer and controls, respectively, being tested at different stages of the design. Green and red dots in the inverted cone represent SNPs being tested at each stage. The red dots are markers for disease susceptibility alleles. Mapowanie zmian Analiza funkcjonalna Garcia-Closas M , Chanock S Clin Cancer Res 2008;14: ©2008 by American Association for Cancer Research

12 Polimorfizmy dla GWAS wysoka częstość, MAF (minor allele frequency) >5% ~7 mln SNP o częstości MAF >5% ~4 mln SNP o częstości 1-5% brak sprzężenia SNP nie powinny znajdować się w genomie blisko siebie w tzw. nierównowadze sprzężeń (linkage disequilibrium) wykorzystanie mikromacierzy Affymetrix Illumina

13 Projekt HapMap międzynarodowe przedsięwzięcie obejmujące Japonię, Kanadę, Chiny, Nigerię i USA w celu identyfikacji oraz określenia częstości zmian polimorficznych w genomie ludzkim w różnych populacjach 270 osób: 90 z Nigerii 45 z Japonii 45 z Chin 90 z Europy północnej i zachodniej

14 Analiza mikromacierzywytworzenie mikromacierzy naniesienie na płytkę gotowych lub zsyntetyzowanych in situ sond długości nukleotydów mikromacierz Sonda oligonukleotydowa

15 Analiza mikromacierzyhybrydyzacja DNA na płytce zawierającej sondy

16 Analiza mikromacierzyskanowanie

17 Analiza mikromacierzyanaliza ilościowa

18 Analiza mikromacierzyAffymetrix Illumina

19 Affymetrix „chip” strategia wyboru SNP: sondy detekcjaAffymetrix's Genome-Wide Human SNP Array 6.0 zawiera sondy dla SNP i CNV strategia wyboru SNP: tylko połowa w oparciu o projekt HapMap, tzw. haplotype - tagging „tagSNPs”, reszta to dowolne SNPs występujące w genomie sondy 25-nukleotydowe, 4-6 kopii/zmianę detekcja hybrydyzacja wyznakowanego DNA

20 Trawienie enzymami restrykcyjnymiLigacja z adapterem Nsp lub Sty Amplifikacja PCR z jednym starterem Oczyszczenie próbki Fragmentacja, znakowanie końców Hybrydyzacja

21 Illumina „chip” HumanOmni2.5-Quad BeadChip zawiera > 2.45 milliona sond do badania SNPs i CNVs strategia wyboru SNPs: w oparciu o projekt HapMap, tzw. haplotype - tagging „tagSNPs” sondy 50-nukleotydowe, 1/zmianę detekcja wydłużanie sond z dobudowaniem znakowanych nukleotydów

22 Hybrydyzacja DNA z sondąGenomowe DNA ( ng) Amplifikacja DNA Fragmentacja DNA 2-etapowa detekcja Etap I Hybrydyzacja DNA z sondą Etap II Wydłużanie sond z dobudowaniem wyznakowanych nukleotydów

23 Zestawienie wykonanych GWAS~ 600 GWAS obejmujących różne grupy i populacje 150 różnych zespołów np. cukrzyca typu I i II, choroba Crohna, choroba Alzheimera, schizofrenia, udar, choroby serca, nowotwory złośliwe, otyłość > SNP wyselekcjonowanych do walidacji zidentyfikowano ~800 SNP związanych z chorobami (p<5×10-8) Johnson and O'Donnell, BMC Medical Genetics 2009 Manolio, NEJM 2010

24 Manolio et al., NEJM 2010

25 Badanie Wellcome Trust 2005-20078 ważnych schorzeń wieloczynnikowych osób (chorych i zdrowych) polimorfizmów (SNPs i CNVs) 200 badaczy, 9 milionów funtów https://www.wtccc.org.uk/ccc1/ Nature 2007, Nature 2010

26 Wyniki badań Wellcome TrustChoroba afektywna dwubiegunowa locus 16p12 (OR 2,08) Choroba wieńcowa locus 9p21 (ORhet-hom 1,47-1,9) Choroba Crohna 5 znanych lokalizacji (ORhet-hom): NOD2 (1,29-1,92), IL23R (1,39-1,86), ATG16L1 (1,19-1,85), ZNF365 (1,23-1,55), locus 5p13.1 (1,54-2,32) 4 nowe lokalizacje (ORhet-hom): IRGM (1,54-1,92), BSN (1,09-1,84), NKX2-3 (1,2-1,62), PTPN2 (1,3-2,01)

27 Wyniki badań Wellcome TrustNadciśnienie brak wyraźnych czynników ryzyka - kilka wariantów o stosunkowo małym wpływie (OR 0,97-1,6) Reumatoidalne zapalenie stawów 9 znanych już lokalizacji (OR 0,91-2,3) PTPN22 (ORhet-hom 1,98-3,32), region MHC (ORhet-hom 2,36-5,21) korelacja z chorobami serca i cukrzycą typu I

28 Wyniki badań Wellcome TrustCukrzyca typu I 5 znanych lokalizacji, w tym gen PTPN22 (ORhet-hom 1,82-5,19) i MHC (ORhet-hom 5,49-18,52) 3 nowe loci (ORhet-hom ): 12q13 (1,34-1,75), 12q24 (1,34-1,94), 16p13 (1,19-1,55) Cukrzyca typu II TCFL2 (ORhet-hom 1,36-1,88), FTO (ORhet-hom 1,34-1,55), CDKAL1/CDKARAP1 (ORhet-hom 1,18-2,17)

29 Znaczenie medyczne identyfikacja grup zwiększonego ryzyka zachorowania na określone choroby związek z pojedynczym markerem, tzw. „single effect” sumowanie ryzyka, tzw. „additive effect” np. OR 1,62 (1 SNP) i OR 9,46 (≥5 SNPs) dla raka prostaty Pharoah et al. NEJM 2008 Zheng et al. NEJM 2008

30 Zmiany zidentyfikowane w GWASfunkcjonalne niefunkcjonalne markery genetyczne identyfikują obszar/gen gdzie należy szukać właściwych mutacji

31 Sekwencjonowanie DNA Technika umożliwiająca ustalenie kolejności zasad w DNA.

32 Sangera – 1975 rok Maxama-Gilberta – 1977 rokpolega na terminacji łańcucha DNA przy wykorzystaniu zmodyfikowanych nukleotydów (dideoksynukleotydy) Maxama-Gilberta – 1977 rok polega na wykorzystaniu związków chemicznych do rozszczepiania łańcucha DNA

33 oparte na metodyce Sangeraautomatyczne – 1987 rok oparte na metodyce Sangera

34 3730xl DNA Analyzer 96 kapilar 3 840 próbek/dobę 2 100 000 zasad/dobędo 900 zasad/próbkę

35 pirosekwencjonowanie – 1996 rok„sekwencjonowanie poprzez syntezę” w reakcji wykorzystywane są cztery enzymy: fragment Klenowa polimerazy DNA I sulfurylaza ATP lucyferaza apiraza.

36 PyroMark Q96 MD do 96 próbek analizowanych jednocześniemax zasad/próbkę do 960 próbek/dobę krótka procedura przygotowania próbek

37 Sekwencjonowanie nowej generacjiAnaliza setek milionów lub miliardów par zasad w jednym ciągu reakcji, przy jednoczesnym obniżeniu kosztów System 454 (Roche) HiSeq (Illumina) SOLiD (Applied Biosystems)

38 System 454 w oparciu o pirosekwencjonowanie >1mln zasad/analizę1 mld zasad/dobę do 450 zasad/próbkę czułość 99% koszt $/analizę

39 HiSeq2000 w oparciu o odwracalną reakcję terminacjijednoczesna analiza dwóch różnych próbek 200 mld zasad/analizę, 8 dni do 25 mld zasad/dobę do 100 zasad/próbkę czułość >99% koszt $/analizę

40 5500xl SOLiD™ System w oparciu o ligację komplementarnych frag.jednoczesna analiza 12 różnych próbek 300 mld zasad/analizę, 7 dni do 45 mld zasad/dobę do 75 zasad/próbkę czułość 99.99% koszt $/analizę

41 Postęp w sekwencjonowaniu

42 Podsumowanie najlepsze efekty daje połączenie kilku metodkonieczne nowej jakości badania strukturalne i asocjacyjne : RNA białek innych oddziaływań ze środowiskiem o nieznanym dotąd charakterze

43