1 Y OTROS FACTORES DE VIRULENCIA EN Brucella spp.PROTEINAS DE MEMBRANA EXTERNA DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 DE Brucella ovis Y OTROS FACTORES DE VIRULENCIA EN Brucella spp. Paola Andrea Caro-Hernández PhD.
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3 Herida de implante mamarioGÉNERO Brucella spp. Brucella melitensis Brucella ovis Brucella neotomae Brucella pinnipedialis Brucella abortus Brucella ceti Brucella suis Brucella canis Brucella inopinata Brucella microti Herida de implante mamario
4 LA ENVOLTURA CELULAR DE Brucella spp.PME OMPs Extraido de: Int J Microbiol. Haag AF., et al (2010)
5 OBJETIVO Profundizar en el estudio de las proteínas homólogas de la familia Omp25/Omp31 para establecer el papel que juegan en la virulencia de Brucella ovis y su potencial como antígenos protectores o de diagnóstico. B. ovis Cepa virulenta que no presenta cadenas O Las OMPs podrían tener mayor relevancia en el proceso infeccioso
6 PROTEÍNAS DE MEMBRANA EXTERNA DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 DE Brucella spp.Omp25b Omp25 Omp25c Omp25d Omp31 Omp31b Omp22 (Omp3b) Extraido de: Salhi et al. (2003)
7 PRESENCIA DE LAS OMPS DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 EN EL GÉNERO Brucellaomp31b omp25 omp25b omp25c omp25d omp22 B. melitensis + - B. abortus B. suis B. neotomae B. ovis B. canis B. pinnipediae B. cetaceae (mayoría de cepas) (4 cepas) -? Microbes and Infection 6: 821–834 Vizcaíno N., et al 2004
8 FRAGMENTO DE ADN DE 15.1 Kb AUSENTE EN B. ovisExtraído de: Microbes and Infection 6: 821–834 Vizcaíno N., et al 2004
9 EVALUACIÓN DE LA ANTIGENICIDAD DE LAS OMPS DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 EN B. ovisObtención de cepas mutantes y complementadas en B. ovis PA Obtención de anticuerpos policlonales en conejo Detección inmunológica mediante Western blot
10 RECOMBINACIÓN HOMOLOGA DOBLECromosoma de B. ovis PA RsrII StuI ∆omp22 omp22 kan r Cepas kanr, sacs y ampr 2 2 1 1 kan r omp22 inactivado Denominación Genotipo relevante ∆omp31 omp31, kanr ∆omp25 omp25:: kanr ∆omp25c omp25c, kanr ∆omp25d omp25d, kanr ∆omp22 omp22, kanr pNV22-1 (9347 pb) sacB Amp r Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
11 CEPAS MUTANTES TRANSFORMADAS CON EL GEN SILVESTREC/u de los gen silvestre omp25/omp31 B. ovis clonados en el vector pBBR1MCS-4 Denominación ∆omp31-Com ∆omp25-Com ∆omp25c-Com ∆omp25d-Com ∆omp22-Com amp r omp25/omp31 LacZ Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
12 B. ovis PA COMPLEMENTADA CONomp31b y omp25b Gen omp31b B. abortus clonado en pBBRMCS-4 Fragmento de ADN de 15kb B. melitensis clonado en pBBRMCS-2 pNV31b-com omp31b amp r pNV kan r omp25b PA omp31b-Com PA (Caro-Hernández P., et al 2007) (Vizcaíno et al., 2004)
13 Expresión de las OMPs DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 en E. coliomp25, omp31, omp25c, omp25d, omp22 de B. ovis PA omp25b de B. melitensis 16M omp31b de B. abortus 544 Amplificación por PCR pGEM TEasy pUC19 Clonación E. coli Transformación Secuenciación Confirmación de los constructos
14 OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES FRENTE A LAS OMPS DE LA FAMILIA Omp25/Omp31de suero 1ª inoculación 2ª inoculación 3ª inoculación 1 SEMANA 1 SEMANA 1 SEMANA INÓCULO células suspensión D. O. = 6 Adyuvante Completo de Freund Adyuvante Incompleto de Freund Punción cardiaca Sin adyuvante IPTG E. coli Adsorción de sueros Intradérmica Subcutánea Subcutánea Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
15 WESTERN BLOT + - Omp31 Omp31b Omp25 Omp25b Omp25c Omp25d Omp22B. ovis PA + - ∆ omp25 ∆ omp25c ∆ omp25d ∆ omp22 ∆ omp31 ∆ omp25 com ∆ omp25c com ∆ omp25d com ∆ omp22 com B. ovis PA 25b com B. ovis PA 31b com Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
16 PAPEL DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 EN LA VIRULENCIA DE B. ovis PAEvaluación de virulencia en ratones BALB/c de los mutantes B. ovis PA en los genes de la familia omp25/omp31 de
17 EVALUACIÓN DE VIRULENCIA EN EL MODELODEL RATÓN BALB/c Vía de Inoculación Intraperitoneal Dosis inoculada 5x10 6 UFC/ratón Ratones BALB/c 35 ratones/cepa Semanas de sacrificio Ratones sacrificados 1, 2, 3, 5, 7, 9 y 11 p.i. n=5 Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
18 ANÁLISIS DE LA IMPLICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 EN LA VIRULENCIA DE B. ovisAnálisis estadístico PLSD de Fisher Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
19 ANÁLISIS DE LA IMPLICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 EN LA VIRULENCIA DE B. ovisInfection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
20 ANÁLISIS DE LA IMPLICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 EN LA VIRULENCIA DE B. ovisInfection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
21 LAS PROTEÍNAS Omp25 y Omp22 INFLUYEN EN LA CAPACIDAD INVASIVA Y DE PROLIFERACIÓNCÉLULAS HELA MACRÓFAGOS MURINOS J774A.1 Microbes and Infection 10: Martín-Martín., et al (2008)
22 INFECCIÓN DE Brucella spp. EN MACROFAGOSS-LPS dependiente de la activación de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3-K) y no induce la activación del macrófago SR-A La entrada de B. ovis y B. canis en el macrófago es independiente de la activación de P13-K Microbes and Infection 12: Martín-Martín., et al (2010) Extraido de: Int J Microbiol. Haag AF., et al (2010)
23 TRÁFICO INTRACELULAR DE Brucella spp.virB, OMP25, OMP22 Sistema de Secreción Tipo 4 (T4SS) Codificado por vir El sistema regulador de dos componentes BvrR/BvrS La proteína BacA Los periplasmáticos glucanos ciclicos ß-1,2 (CßGs), Han demostrado estar involucrados en supervivencia dentro de los fagocitos en modelos animales Martin-Martin ., Et al (2010) (2012) Microbes and Infection 12: Martín-Martín., et al (2010) Infection and Immunity Martín-Martín., et al (2012) Extraido de: . Med Microbiol Immunol. 198(4): R. Martin Roop II., et al (2009)
24 CONCLUSIONES Los genes que codifican para la familia Omp25/Omp31 se encuentran conservados en el género Brucella, sin embargo, varias diferencias importantes en su secuencia de ADN fueron encontradas entre la especies. Este polimorfismo podría estar involucrado en la diferencia de virulencia y preferencia de hospedador existente entre las especies de Brucella Los sueros obtenidos en conejo frente a las PME de la familia Omp25/Omp31 de Brucella spp. han permitido determinar que las proteínas Omp31, Omp25, Omp25c y Omp22 se sintetizan en B. ovis PA. Por el contrario, las proteínas Omp31b y Omp25b no se han detectado en esta bacteria, resultados esperados teniendo en cuenta observaciones previas a nivel del ADN, pero sí se han detectado en la cepas de B. ovis PA complementadas con genes Omp31b y Omp25b funcionales, lo que comprueba su antigenicidad.
25 CONCLUSIONES El papel de las proteínas Omp31, Omp25 y Omp25c en la virulencia en ratón de B. ovis PA parece poco relevante. Sin embargo, no se puede descartar su implicación en el establecimiento de un proceso infeccioso en carneros, aspecto que sería interesante evaluar. Las proteínas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B. ovis en ratón, por lo que sería interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B. ovis en carneros y también su implicación en la virulencia de otras especies del género Brucella. A pesar de que Brucella spp. no posee los típicos factores de virulencia, presenta factores de virulencia especializados como son: LPS, cadenas O, OMPs, BacA, T4SS, BvrR/BvrS, (CßGs)
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27 Omp25 Suero anti-Omp25 y AcM anti-Omp25 Omp25 Omp25 kDa MP 31 21,5B. ovis PA Δomp25 Δ25-Com Infect Immun. 75 (8): (2007). Role of the Omp25/Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino Vet Microbiol. 28; 137 (1-2): (2009) Martín-Martín AI, Caro-Hernández P, Sancho P, Tejedor C, Cloeckaert A, Fernández-Lago L, Vizcaíno N. (2009). Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25/Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species.
28 Omp25b WESTERN BLOT Suero Suero anti-Omp anti-Omp25b Omp25c Omp25cb 25c kDa Omp25b 31 Omp25c Omp25c Omp25b 21,5 PA Δ25c Com PA (omp25b) Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
29 WESTERN BLOT Suero anti-Omp25c MP kDa Omp25c 31 Omp25 Omp25c Omp25c Omp25 21,5 PA Δ25cCom Δ25 Com Omp25c presenta 2 bandas entre a 30.5 kDa y debido a la similitud de antigenicidad se observa la banda de 25.9 KDa de la proteína Omp25 Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
30 Omp31 Suero anti-Omp31 y AcM anti-Omp31 Omp31 Omp31 Δ31-Com B. ovis PAkDa MP Omp31 31 Omp31 Omp31 21,5 B. ovis PA Δomp31 Δ31-Com Infect Immun. 75 (8): (2007). Role of the Omp25/Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino Vet Microbiol. 28; 137 (1-2): (2009) Martín-Martín AI, Caro-Hernández P, Sancho P, Tejedor C, Cloeckaert A, Fernández-Lago L, Vizcaíno N. (2009). Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25/Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species.
31 Omp31b WESTERN BLOT Suero anti-Omp31b Omp31b Omp31 Omp31 Omp31 PA AntikDa Omp31b Omp31b 31 Omp31 Omp31 Omp31 21,5 31 Com 31b Com PA Δ31 Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
32 Suero anti Omp22 purificadaWESTERN BLOT Suero anti Omp22 purificada PA Δ Com E. coli /Omp C(-) Omp22 Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007) Vet. Microbiol 137:74-82, Martín-Martín AI., et al (2009)
33 Bibliografia Briones G, et al Brucella abortus cyclic ß-1,2-glucan mutants have reduced virulence in mice and are defective in intracellular replication in HeLa cells. Infect. Immun. 69:4528–4535. Caro-Hernández P, et al Role of the Omp25/Omp31 family in outer membrane properties and virulence of Brucella ovis. Infect. Immun. 75:4050–4061. Delrue RM, et al A quorum-sensing regulator controls expression of both the type IV secretion system and the flagellar apparatus of Brucella melitensis. Cell. Microbiol. 7:1151–1161. Delrue RM, et al Identification of Brucella spp. genes involved in intracellular trafficking. Cell. Microbiol. 3:487– 497. Haag AF, Myka KK, Arnold MF, Caro-Hernández P, Ferguson GP. Importance of Lipopolysaccharide and Cyclic β-1,2-Glucans in Brucella-Mammalian Infections. Int J Microbiol. 2010;2010: Epub 2010 Dec 1. Martín-Martín AI, Caro-Hernández P, Sancho P, Tejedor C, Cloeckaert A, Fernández-Lago L, Vizcaíno N. (2009). Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25/Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species. Vet Microbiol. 28; 137 (1-2): (2009) Martín-Martín AI, Sancho P, de Miguel MJ, Fernández-Lago L, Vizcaíno N.. Quorum-sensing and BvrR/BvrS regulation, the type IV secretion system, cyclic glucans, and BacA in the virulence of Brucella ovis: similarities to and differences from smooth brucellae. Infect Immun May;80(5): Epub 2012 Mar 5 O’Callaghan D, et al A homologue of the Agrobacterium tumefaciens VirB and Bordetella pertussis Ptl type IV secretion systems is essential for intracellular survival of Brucella suis. Mol. Microbiol. 33:1210 –1220 Roop RM 2nd, Gaines JM, Anderson ES, Caswell CC, Martin DW. Survival of the fittest: how Brucella strains adapt to their intracellular niche in the host. Med Microbiol Immunol Nov;198(4): Epub 2009 Sep 22. Salhi I, et al Characterization of new members of the group 3 outer membrane protein family of Brucella spp. Infect. Immun.71:4326–4332 Sola-Landa A, et al A two-component regulatory system playing a critical role in plant pathogens and endosymbionts is present in Brucellaabortus and controls cell invasion and virulence. Mol. Microbiol. 29:125–138. Vizcaino N, Caro-Hernández P, Cloeckaert A, Fernandez-Lago L.. DNA polymorphism in the omp25/omp31 family of Brucella spp.: identification of a 1.7-kb inversion in Brucella cetaceae and of a 15.1-kb genomic island, absent from Brucella ovis, related to the synthesis of smooth lipopolysaccharide Microbes Infect.;6 (9): (2004)..