1 Zasady analizy FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting, cytometria przepływowa, cytofluorymetria)Cytometria – metoda pomiaru właściwości fizycznych i chemicznych pojedynczych komórek lub obiektów biologicznych (jądra komórkowe, mitochondria, chloroplasty) 2 rodzaje cytometrów przepływowych: analizator sorter

2 Historia: 1934 – publikacja opisująca metodę liczenia komórek przepływających w kapilarze (czujnik fotoelektryczny) 1947 – pierwsze doniesienie o cytofluorymetrycznej detekcji bakterii w aerozolach (badania sponsorowane przez armię USA) urządzenie: detekcja w komorze przepływu w ciemnym polu – oświetlenie światłem widzialnym – detekcja cząstek o średnicy 0.6um 1953 – Wallace Coulter patentuje urządzenie do liczenia krwinek w strumieniu cieczy (wykorzystuje czujnik fotoelektryczny i zasadę ogniskowania hydrodynamicznego)

3 Budowa cytometru

4 Część hydrauliczna transportuje obiekty w strumieniu cieczy do komory pomiarowej zapewnia oddzielny przepływ pojedynczych obiektów ogniskuje przepływające obiekty w środku wiązki lasera

5 Część hydrauliczna (ogniskowanie hydrodynamiczne)zawiesina próbki zawiesina obiektów jest wtłaczana w otoczce płynu osłaniającego do dyszy płyn osłaniający płynie szybciej od centralnego strumienia próbki przepływ laminarny centralnego strumienia (o średnicy ok. 30um) umożliwia przepływ pojedynczych obiektów przed optoelektronicznymi układami rejestrującymi płyn osłaniający

6 Część hydrauliczna szybkość przepływu 12 – 300 ul/min. szybkość akwizycji 300 – komórek/s szybkość akwizycji zależy od gęstości obiektów !

7 Układ optyczny

8 Fluorescencja w układzie optycznymEmisja fotonu następuje wtedy, kiedy elektron powraca z wyższej (stan wzbudzenia) orbity na niższą (stan spoczynku)

9 Fluorescencja w układzie optycznymPrawo Stokes’a długość fali emisyjnego promieniowania fluorescencyjnego jest zawsze większa od długości fali promieniowania wzbudzającego fluorescencję Przesunięcie Stokes’a - różnica energii pomiędzy pikiem absorpcji a pikiem emisji Stokes Shift is 25 nm Cząsteczka fluoresceiny 495 nm 520 nm Intensywność fluorescencji Długość fali

10 Rodzaje stosowanych fluorochromów autofluorescencja NADPH, chlorofil, melanina, kolagen, tyrozyna, tryptofan białka wykazujące fluorescencję GFP i jego odmiany: EGFP, ECFP, EYFP DsRed 3. aromatyczne związki organiczne fluoresceina, rodamina, Cy3, DAPI, Alexa Fluor 4. kropki kwantowe

11 Budowa kropek kwantowych rdzeń – selenid kadmu lub telurid kadmu powłoka siarczkowo-cynkowa powłoka polimerowa (umożliwia uzyskanie rozpuszczalności w wodzie, pozwala na koniugowanie nanokryształu z p.ciałem, nukleotydem, streptawidyną; PEG pełni funkcję łącznika) cząsteczka biologiczna Molecular Probes

12 Właściwości kropek kwantowych: rozmiar zbliżony do dużego białka jednakowe spektrum absorpcji rozmiar kryształu determinuje barwę emisji silna fluorescencja ‘wypalanie’ barwnika nieznaczne Molecular Probes

13 najczęściej wykorzystywane lasery: argonowy – niebieski (488nm) Układ optyczny najczęściej wykorzystywane lasery: argonowy – niebieski (488nm) diodowy – czerwony (635nm) analiza: zielony, żółty, czerwony, daleki czerwony

14 Układ optyczny rodzaje filtrówgórnoprzepustowy dolnoprzepustowy pasmowy

15 Układ optyczny analizowanie obiektów barwionych kilkoma fluorochromami → spektra emisyjne nakładają się kompensacja – proces polegający na eliminacji nakładających się zakresów emisji

16 Układ elektroniczny przetwarza sygnał analogowy na cyfrowy pomiar wielkości napięcia przeprowadza kompensację

17 Wykresy dwuwymiarowe konturowy – zawiera dodatkową informację (3 wymiar) o ilości zdarzeń posiadających określone parametry x-y rozproszenia – 2 parametry jednocześnie, każda oś oznacza intensywność, każda kropka – 1 zdarzenie gęstości – kolor oznacza akumulację określonych zdarzeń

18 histogram 3-D – oś Z oznacza ilość zdarzeńhistogram – pojedynczy parametr a ilość zdarzeń

19 Określone populacje (spełniające zadane kryteria) obiektów mogą zostać wyselekcjonowane i oddzielone od innych przez bramkowanie zastosowanie w mieszanych populacjach obiektów do analizy określonych parametrów lub w sortowaniu do uzyskania homogennej populacji

20 (forward scatter) - wielkość SSC (side scatter) - ziarnistośćRodzaje danych uzyskiwanych w cytometrii laser detektor przedni FSC (forward scatter) - wielkość detektor boczny SSC (side scatter) - ziarnistość Purdue University Cytometry Laboratories

21 SSC Laser FSC Rozproszenie na wprostDetektor rozproszenia pod kątem 90 stopni- granulacja komórek i obecność struktur komórkowych SSC Detektor rozproszenia na wprost – informacja o wielkości komórki lub cząsteczki badanej Laser FSC Rozproszenie na wprost Określa wielkość komórki Mierzone wzdłuż osi padającego lasera na wprost Rozproszenie boczne—światło lasaerowe odbite i rozproszone Określa gęstość i liczbę ziarnistości (względnie) Mierzona pod kątem 90° w stosunku do wiązki laserowej

22 Rozproszenie na wprost (FSC)Wielkość Laser mała ~ mały FSC Laser duża ~ wysoki FSC

23 Zasady analizy FACS – analiza ziarnistości i wielkościNEUTROFILE FSC MONOCYTY 200 400 600 800 1000 90 Degree Scatter LIMFOCYTY SSC Purdue University Cytometry Laboratories

24 detektory fluorescencjiRodzaje danych uzyskiwanych w cytometrii– analiza fluorescencji detektor przedni laser komórek Ilość Fluorescencja detektory fluorescencji (PMT3, PMT4 etc.) Purdue University Cytometry Laboratories

25 Zasady analizy FACS – analiza fluorescencjiżółta fluorescencja zielona fluorescencja Purdue University Cytometry Laboratories

26 Zasady sortowania metodą FACSna zasadzie mechanicznego wychwytu wybranej populacji obiektów przez kapilarę poruszającą się ruchem wahadłowym w strumieniu cieczy (‘catcher-tube sorting’) słaba wydajność (300 komórek/s) duże rozcieńczenie sortowanych obiektów

27 Zasady sortowania metodą FACSsortery kroplowe – wykorzystują drgania kryształu piezoelektrycznego powodującego rozerwanie strumienia cieczy w komorze przepływu na pojedyncze krople w zależności od posiadanego ładunku na powierzchni obiekty są odchylane w polu elektrycznym (wytwarzanym przez płytki odchylające) do odpowiednich probówek możliwość sortowania do 4 różnych populacji jednocześnie szybkość sortowania do komórek/s

28 kryształ piezoelektryczny

29 Wykorzystanie ocena subpopulacji limfocytów (niedobory immunologiczne, ocena skuteczności immunosupresji) oznaczanie antygenów HLA (transplantologia) oznaczanie antygenów HLA B27 (ocena schorzeń autoimmunologicznych) ocena stopnia degranulacji bazofilów i poziom limfocytów Th1 i Th2 (alergologia) identyfikacja mutacji chromosomalnych np. chromosom Filadelfia (cytogenetyka) sortowanie komórek macierzystych (przeszczepy) sortowanie gamet męskich z chromosomem X i Y (zapłodnienie pozaustrojowe)

30 Przykład zastosowania Zawartość DNA w komórkach w hodowli asynchronicznej barwienie jodkiem propidyny – PI, pozwala ocenić fazy cyklu komórkowego Count 200 400 600 800 1000 G0 / G1 S G2 / M zawartość DNA 2N 4N G2 M G0 G1 S

31 HISTOGRAM DNA pik G0-G1 odpowiada ilości DNA = 2n w fazie G0 i G1G2-M obszar S to rozkład zawartości DNA w fazie S cyklu komórkowego ilość komórek S pik G2-M odpowiada ilości DNA = 4n w fazie G2 i M intensywność fluorescencji PI

32 Mikroskopia fluorescencyjnaMolecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002.

33 Mikroskopia fluorescencyjnaMolecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002.

34 Mikroskopia konfokalnaMolecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002.

35 Dekonwolucja w mikroskopiiZaawansowana technika komputerowej obróbki obrazu mikroskopowego (w formie stosów obrazów – tj. przekrojów w różnych płaszczyznach ostrości) pozwalająca na wyeliminowanie zakłóceń pochodzących z innych płaszczyzn optycznych