1 Zastosowanie kalorymetrii ITC w badaniach białekKatarzyna Breer

2 Kalorymetria, czyli ,,mierzenie ciepła’’DSC (differential scanning calorimetry) ITC (isothermal titration calorimetry)

3 Current Opinion in Structural BiologyT – const, p – const 81 mM domena SH2 Lck ligand 0.4mM fosfopeptyd TEGOqYQPQPA Current Opinion in Structural Biology Leavitt and Freire 2001

4 Warianty metody Enzym/substrat/inhibitor Single injectionDysocjacja (dimeru)

5 Kalorymetr ITC VP-ITC Objętość celki ~1.4 mlObjętość strzykawki ~ 270ml Peltier 2-800C Szum 0.5 ncal/s

6 Jakie informacje można uzyskać z krzywej miareczkowania ITC?Miareczkowanie ~8 mM PNP (cielęce) Guaniną 20 mM Hepes pH 7.0, 250C DQL=DHL DHcal DQML=DHML

7 Identyczne, nieoddziałujące miejsca wiązania – frakcja miejsc zajętych 1-  – frakcja miejsc wolnych [L]t = [L] + n[M]t Q = n[M]t ·V0DHML

8 Parametr sigmoidalnościC = Ka [M]t 10 < C < 1000 Ka ~108 – 109 M-1 Wiseman et al. 1989

9 Proteaza HIV-1 KA ~KB Leavitt and Freire 2001

10 Wiązanie kompetycyjneSłaby inhibitor Silny inhibitor DQ(i) = V0 [M]t (DHADA(i) + DHBDB(i)) Sigurskjold 2000

11 Parametry termodynamiczneU(S,V,N) = TS – pV + SmN dU (S,V,N) = TdS – pdV + SmidNi Naturalne zmienne ITC to (T,p,N) G (T,p,N) = U – TS + pV = SmiNi Energia chemiczna dG (T,p,N) = –SdT + Vdp + SmidNi dG  0 Proces spontaniczny

12 Związek entalpii, entropii i energii swobodnej GibbsaG = U + pV – TS = H – TS dG = dH – TdS Wkład entropowy Solwatacja Wewnętrzne stopnie swobody Wkład entalpowy (cieplny) Wiązania wodorowe Oddziaływania van der Waalsa Oddziaływania elektrostatyczne

13 DG = -RTln Ka ~8 mM PNP ~0.2 mM PNP 250C, 20 mM Hepes pH 7.0DHcal =  0.1 kcal/mol TDS = -5.0 kcal/mol ~8 mM PNP DG = -RTln Ka 250C, 20 mM Hepes pH 7.0 N = 0.5  0.1 Ka = (11.3  0.9) 106 M-1 ~0.2 mM PNP

14 [M]t = 0.92 mM [M]akt = 0.96 mM Ka = (5.3  2.5) 109 M-1

15 Zachowania nieszablonoweMiejsca oddziałujące – kooperacja Niezależnie wiążące miejsca [L]t = [L] + [M]t(n11DH1+n22DH2) Q = [M]tV0(n11DH1 + n22DH2)

16

17 Miareczkowania PNP ligandem DFPP-DGK1 = (6.7  6.4 ) 1010 M-1 DH1 = -6.3  0.05 kcal/mol TDS1 = 8.2 kcal/mol N2 = 0.2 K2 = (3.1  2.8) 108 M-1 DH2 = 5.8  0.2 kcal/mol TDS2 = 17.6 kcal/mol N = 1.0 Ka = (1.2  0.5) 109 M-1 DH = -5.7  0.04 kcal/mol TDS = 6.6 kcal/mol 20 mM Hepes pH 7.0, 200C

18 Analiza van’t Hoff’a Ka Entalpia van’t Hoff’a Izobara van’t Hoff’a

19 Ka Entalpia van’t Hoff’a

20 Forma całkowa izobary van’t Hoff’aPolimeraza Klenowa Forma całkowa izobary van’t Hoff’a Datta et al., 2006

21 Napędzana entalpowo TSNapędzana entropowo TH Napędzana entalpowo TS DCp ~ - (0.9 – 1.2) kcal/(mol K)

22 Zależność DHcal(T) dla wiązania DFPP-DG przez PNPDCp – const. DCp =  kcal/(mol K)

23 Zależność Kas (T) Kas ~ M-1 Poza zakresem pracy metody

24  ligand Guanina N = 0.9 Ka = (1.4  0.1) 107 M-1DH =  0.1 kcal/mol TDS = -2.4 kcal/mol N1 = 1.0 K1 = (0.2  1.7) 1011 M-1 DH1 = -6.2  0.1 kcal/mol TDS1 = 7.6 kcal/mol N2 = 0.1 K2 = (0.4  3.0) 109 M-1 DH2 = 9.6  2.6 kcal/mol TDS2 = 1.7 kcal/mol  ligand Guanina

25 Zmiany entropii i entalpiiDH (T) = DHconf (T) + DHintrinsic (T) DS (T)= DSsolv (T) + DSconf (T) + DSinne(T) DSsolv (T) = DCpln(T/TS)

26 ASA solvent accessible surface areaDH = DHconf + a(T)·DASAap + b(T) ·DASApol DCp ap < DCp pol > 0 Luić et al. 2004

27 Kompleksy białko – białkoFab E8 cytochrom c oraz przeciwciało E8 DCp ~ - (0.2 – 0.6) kcal/(mol K) Mylvaganam et al., 1998

28 DHcal – DHvH = const

29 Przepływ protonów DHapp = DHbind + nH+DHion Acetate 0.1 kcal/molTodd et al., 2000 DHapp = DHbind + nH+DHion Miareczkowania proteazy HIV-1 indivinavirem Acetate 0.1 kcal/mol MES 3.7 kcal/mol ACES 7.5 kcal/mol

30 Równowaga dynamiczna Kconf K1 K0 log Kconf DCp app jedna forma wiążeobie formy wiążą ligand Eftink et al., 1983

31 Kompleksy białko – DNA Temperature Dragan et al., 2004

32 Jak projektować inhibitory?4·109 M-1 5·1010 M-1 9·1010 M-1 1011 M-1

33 130x x x x Mutant V82F/I84V Muzammil et al., 2007

34 MDR mutant 700x x x x

35 Allosteria ,,entropowa”Białko CAP

36 BRAK ZMIAN KONFORMACYJNYCHNa podstawie widm NMR 2D 1H-15N HSQC BRAK ZMIAN KONFORMACYJNYCH

37 ms – ms powolne ruchy domen

38 Podziękowania dla: Romana Szczepanowskiego Matthias’a Bochtler’a

39 DS > 0 woda została wypchnięta z powierzchni kompleksu Energie wiązań: Elektrostatyczne w wodzie ~1A 20kJ/mol Wodorowe kJ/mol Hydrofobowe kJ/mol van der Waalsa kJ/mol DS > 0 woda została wypchnięta z powierzchni kompleksu DS < 0 może mieć wiele przyczyn i nie koniecznie znaczyć, że hydratacja wzrosła, bądź się nie zmieniła